Le biotecnologie sono tutte le tecnologie che si avvalgono di organismi o biomolecole per produrre beni e servizi utili. Alcuni dei più antichi esempi di biotecnologie sono la selezione e incrocio artificiale di varie colture, portando a varietà poliploidi a partire da diploidi. Un altro esempio è la fermentazione alcolica, la panificazione e la fermentazione lattica, usate per produrre alcolici, pane e yogurt.
La branca delle biotecnologie che manipolano e trasferiscono da un organismo all'altro i geni è detta ingegneria genetica (o tecnologia del DNA ricombinante).
I tre pilastri su cui poggia l'ingegneria genetica sono:
Le endonucleasi di restrizione, o enzimi di restrizione, sono proteine enzimatiche della calsse delle idrolasi. Questi enzimi sono specifici per determinati substrati, detti siti di restrizione, che sono costituiti da specifiche sequenze di DNA, dalla lunghezza di 4-8 bp. Una caratteristica comune dei siti di restrizione è quella di essere palindromici (es. 5'→GATTC→3' / 3'←CTTAG←5'): le endonuclesasi di restrizione, che hanno due subunità uguali, individuano la sequenza su uno dei due filamenti e procedono a tagliarlo.
Oltre agli enzimi di restrizione, un altro enzima fondamentale per il DNA ricombinante è la DNA ligasi, che catalizza la formazione di legami fosofidestere tra i nucleotidi esterni ai frammenti di restrizione “tagliati”. Il DNA risultante dall'inserimento così effettuato di un frammento di DNA estratto da un organismo (donatore) in un altro frammento (ospite) è detto DNA ricombinante; esistono due tipi di estremità per i frammenti di DNA, che devono combaciare tra i due DNA affinché funzioni la DNA ligasi:
L'elettroforesi è un processo con cui si discriminano i frammenti di DNA di diversa lunghezza, disponendoli su una matrice gelatinosa e sottoponendoli a una differenza di potenziale elettrico (che determina un campo elettrico grossomodo uniforme). Poiché il DNA ha carica globalmente negativa per via dei gruppi fosfato, il DNA migra verso il polo positivo del generatore di tensione con una velocità che diminuisce con l'aumento del peso molecolare (e dunque della lunghezza in bp). Il gel è immerso in una soluzione salina, che bilancia il pH1) e conduce elettricità.
Il gel più frequentemente utilizzato è l'agarosio, polisaccaride estratto dalle alghe marine. Esso presenta maglie relativamente ampie, e consente di discriminare frammenti con differenze di lunghezza di 10-100 bp. Un'alternativa comune è il poliacrilammide, dall'elevata densità di maglie, che permette di distinguere frammenti con delta di 1 bp.
Il DNA viene disposto in pozzetti in prossimità del polo negativo, e in uno dei pozzetti viene introdotta una miscela detta «marcatore di peso molecolare», che crea delle “tacche” costituite da frammenti di nota lunghezza, fornendo una scala per leggere le lunghezze dei frammenti analizzati.
Per vedere il DNA, esso viene marcato mediante specifiche sonde nucleotidiche: sequenze oligonucleotidiche corrispondenti ai tratti da evidenziare, trattate con isotopi radioattivi degli elementi che le costituiscono, o con un colorante fluorescente.
L'uso di sonde consente di scoprire se i batteri hanno effettivamente inglobato il DNA ricombinante. Posti i batteri su una piastra di coltura che consente di districare le colonie, viene applicato sulla piastra un filtro in nitrocellulosa, a cui alcuni batteri si attaccano. Il dischetto viene trattato per denaturare il DNA e viene ibridato con sonde radioattive complementari al DNA ricombinante da trovare. Viene infine posto su una lastra fotografica e si osservano le macchie sul supporto fotografico, che si sanno corrispondere alle colonie di batteri che presentano il DNA ricombinante.
Il Southern blot permette di diagnosticare malattie genetiche, amplificando il segnale di sequenze brevissime di DNA, difficilmente evidenziabili con la sola elettroforesi e con i coloranti fluorescenti.
Un esempio di malattia diagnosticabile con questo metodo è l'anemia falciforme; essa causa la scomparsa di un sito di restrizione per l'enzima MstII; tagliando il DNA con l'enzima, si ha una differenza di lunghezza di 200 bp in eccesso rispetto alla forma normale del gene. Dopo la restrizione, i frammenti sono sottoposti a elettroforesi su gel e vengono trasferiti su nitrocellulosa; vengono denaturati e ibridati con una sonda che lega entrambi i frammenti antiparalleli; infine viene usata una lastra fotografica che viene impressionata dalle sonde radioattive, e si può misurare in bp la presenza delle bande risultanti, per determinare la presenza o meno del gene malato/sano, o di entrambe le forme (eterozigote).
La polymerase-chain reaction (reazione a catena della polimerasi), comunemente detta PCR, permette di moltiplicare una sequenza di DNA migliaia di volte in pochi minuti. Essa automatizza la duplicazione del DNA, usando DNA polimerasi batteriche termostabili (in particolare la Taq polimerasi), ossia che rimangono stabili ad alte temperature. Oggi per effettuarla si usano termociclatori: questi apparati sottopongono a cicli termici il DNA da replicare.
Ogni ciclo di PCR consiste in tre fasi:
I primer potrebbero agganciarsi anche se non vi è una perfetta complementarietà, quindi la temperatura deve essere elevata, difficoltando la formazione dei legami H e costringendo pertanto i due tratti (DNA ed RNA del primer) ad avere un gran numero di legami validi.
Il sequenziamento del DNA consiste nella determinazione della sequenza ordinata di nucleotidi che lo compongono, e in particolare delle basi che li caratterizzano. Il metodo principale per effettuare il sequenziamento, oggi automatizzato grazie ai sequenziatori, è quello messo a punto da Sanger nel 1975.
Il metodo di Sanger è così strutturato:
Il clonaggio è la replicazione agamica del materiale genetico. Esso avviene spontaneamente nella cellula durante la mitosi, e uno degli obiettivi delle biotecnologie è quello di controllare il processo per ottenere cellule con l'informazione genetica desiderata. Esistono più vettori, ingegnerizzati artificialmente, che possono essere usati per il clonaggio: