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 ===== Enzimi di restrizione e DNA ligasi =====
-Le endonucleasi di restrizione, o enzimi di restrizione, sono proteine [[scienze:enzimi|enzimatiche]] della calsse delle //idrolasi//. Questi enzimi sono specifici per determinati substrati, detti //siti di restrizione//, che sono costituiti da specifiche sequenze di DNA, dalla lunghezza di 4-8 bp. Una caratteristica comune dei siti di restrizione è quella di essere palindromici (es. 5'->GATTC->3' / 3'<-CTTAAG<-5'): le endonuclesasi di restrizione, che hanno due subunità uguali, individuano la sequenza su uno dei due filamenti e procedono a tagliarlo.
+Le endonucleasi di restrizione, o enzimi di restrizione, sono proteine [[scienze:enzimi|enzimatiche]] della calsse delle //idrolasi//. Questi enzimi sono specifici per determinati substrati, detti //siti di restrizione//, che sono costituiti da specifiche sequenze di DNA, dalla lunghezza di 4-8 bp. Una caratteristica comune dei siti di restrizione è quella di essere palindromici (es. 5'->GATTC->3' / 3'<-CTTAG<-5'): le endonuclesasi di restrizione, che hanno due subunità uguali, individuano la sequenza su uno dei due filamenti e procedono a tagliarlo.
 Oltre agli enzimi di restrizione, un altro enzima fondamentale per il DNA ricombinante è la DNA ligasi, che catalizza la formazione di legami fosofidestere tra i nucleotidi esterni ai frammenti di restrizione "tagliati". Il DNA risultante dall'inserimento così effettuato di un frammento di DNA estratto da un organismo (donatore) in un altro frammento (ospite) è detto DNA ricombinante; esistono due tipi di estremità per i frammenti di DNA, che devono combaciare tra i due DNA affinché funzioni la DNA ligasi:
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 L'uso di sonde consente di scoprire se i batteri hanno effettivamente inglobato il DNA ricombinante. Posti i batteri su una piastra di coltura che consente di districare le colonie, viene applicato sulla piastra un filtro in nitrocellulosa, a cui alcuni batteri si attaccano. Il dischetto viene trattato per denaturare il DNA e viene ibridato con sonde radioattive complementari al DNA ricombinante da trovare. Viene infine posto su una lastra fotografica e si osservano le macchie sul supporto fotografico, che si sanno corrispondere alle colonie di batteri che presentano il DNA ricombinante.
+===== Southern blotting =====
+Il //Southern blot// permette di diagnosticare malattie genetiche, amplificando il segnale di sequenze brevissime di DNA, difficilmente evidenziabili con la sola elettroforesi e con i coloranti fluorescenti.
+Un esempio di malattia diagnosticabile con questo metodo è l'anemia falciforme; essa causa la scomparsa di un sito di restrizione per l'enzima MstII; tagliando il DNA con l'enzima, si ha una differenza di lunghezza di 200 bp in eccesso rispetto alla forma normale del gene. Dopo la restrizione, i frammenti sono sottoposti a elettroforesi su gel e vengono trasferiti su nitrocellulosa; vengono denaturati e ibridati con una sonda che lega entrambi i frammenti antiparalleli; infine viene usata una lastra fotografica che viene impressionata dalle sonde radioattive, e si può misurare in bp la presenza delle bande risultanti, per determinare la presenza o meno del gene malato/sano, o di entrambe le forme (eterozigote).
+===== PCR =====
+La polymerase-chain reaction (reazione a catena della polimerasi), comunemente detta PCR, permette di moltiplicare una sequenza di DNA migliaia di volte in pochi minuti. Essa automatizza la duplicazione del DNA, usando DNA polimerasi batteriche termostabili (in particolare la Taq polimerasi), ossia che rimangono stabili ad alte temperature. Oggi per effettuarla si usano termociclatori: questi apparati sottopongono a cicli termici il DNA da replicare.
+Ogni ciclo di PCR consiste in tre fasi:
+  - denaturazione -> avendo un frammento di DNA, è necessario linearizzarlo (separando i due filamenti polinucleotidici): artificialmente, al posto dell'azione dell'elicasi il campione viene riscaldato oltre 92 °C per pochi secondi. Ciò permette di denaturare il DNA, rompendo i legami H e separando i due filamenti polinucleotidici. I legami fosfodiesterici (covalenti) restano intatti.
+  - ibridazione (//annealing//) -> la temperatura viene abbassata sotto i 40-60 °C (viene scelta la temperatura ideale in base al segmento da replicare): i *primer* si appaiano al DNA a singolo filamento
+  - allungamento -> nella miscela di reazione, oltre ad avere il DNA da duplicare e i nucleotidi da unire, viene introdotta la DNA polimerasi e la miscela di reazione è posta in un pH idoneo alla reazione (soluzione salina), sono introdotti i primer complementari al segmento da duplicare, e in seguito all'annealing, agisce una particolare tipologia di DNA polimerasi: la Taq polimerasi (proviene da un batterio che vive nelle bocche dei vulcani subacquei). La temperatura viene alzata nuovamente per ridurre il tasso di formazione degli artefatti di replicazione, raggiungendo 72 °C. A partire dai primer che ormai sono legati al filamento stampo, inizia la sintesi.
+I primer potrebbero agganciarsi anche se non vi è una perfetta complementarietà, quindi la temperatura deve essere elevata, difficoltando la formazione dei legami H e costringendo pertanto i due tratti (DNA ed RNA del primer) ad avere un gran numero di legami validi.
+===== Sequenziamento =====
+Il sequenziamento del DNA consiste nella determinazione della sequenza ordinata di nucleotidi che lo compongono, e in particolare delle basi che li caratterizzano. Il metodo principale per effettuare il sequenziamento, oggi automatizzato grazie ai //sequenziatori//, è quello messo a punto da Sanger nel 1975.
+Il metodo di Sanger è così strutturato:
+  - il DNA (fino a 700 bp) viene frammentato e in seguito denaturato per ottenere un DNA a filamento singolo, e viene addizionata la DNA polimerasi che creerà il filamento complementare allo stampo, assieme agli altri requisiti per la sintesi; complessivamente si hanno:
+    * filamento DNA stampo
+    * DNA polimerasi
+    * //primer// complementare all'estremità 3' del filamento stampo
+    * i 4 tipi di DNTP (deossinucleotidi trifosfato) in //grande quantità//((ossia DATP, DTTP, DGTP, DCTP))
+    * 4 tipi di dDNTP (didesossinucleotidi trifosfato) in //piccola quantità// e marcati con diversi colori fluorescenti
+  - la DNA polimerasi aggiunge i nuovi nucleotidi casualmente, prendendo principalmente DNTP ma usando sporadicamente un dDNTP -> quando ciò avviene, la sintesi del filamento antiparallelo allo stampo si interrompe (non si può estendere un filamento contenente un ddNTP) e il filamento resta con un'estremità marcata con il colore corrispondente a una base nota
+  - i frammenti di diverse lunghezze così ottenuti vengono sottoposti a elettroforesi su gel di poliacrilammide
+  - un lettore ottico individua il colore del ddNTP terminale di ciascun frammento e mediante un software si abbinano i colori dei picchi alle basi dei diversi nucleotidi, sequenziando il frammento
+===== Clonaggio =====
+Il clonaggio è la replicazione agamica del materiale genetico. Esso avviene spontaneamente nella cellula durante la mitosi, e uno degli obiettivi delle biotecnologie è quello di controllare il processo per ottenere cellule con l'informazione genetica desiderata. Esistono più vettori, ingegnerizzati artificialmente, che possono essere usati per il clonaggio:
+  * virus
+  * plasmidi
+  * cromosomi artificiali