Biotecnologie

Le biotecnologie sono tutte le tecnologie che si avvalgono di organismi o biomolecole per produrre beni e servizi utili. Alcuni dei più antichi esempi di biotecnologie sono la selezione e incrocio artificiale di varie colture, portando a varietà poliploidi a partire da diploidi. Un altro esempio è la fermentazione alcolica, la panificazione e la fermentazione lattica, usate per produrre alcolici, pane e yogurt.

La branca delle biotecnologie che manipolano e trasferiscono da un organismo all'altro i geni è detta ingegneria genetica (o tecnologia del DNA ricombinante).

I tre pilastri su cui poggia l'ingegneria genetica sono:

• l'universalità, attraverso tutte le specie, del codice genetico
• l'esistenza di enzimi di restrizione e ligasi, che consentono di tagliare e unire segmenti di DNA
• la messa a punto di sistemi di amplificazione genica, con cui replicare esponenzialmente il DNA

Le endonucleasi di restrizione, o enzimi di restrizione, sono proteine enzimatiche della calsse delle idrolasi. Questi enzimi sono specifici per determinati substrati, detti siti di restrizione, che sono costituiti da specifiche sequenze di DNA, dalla lunghezza di 4-8 bp. Una caratteristica comune dei siti di restrizione è quella di essere palindromici (es. 5'→GATTC→3' / 3'←CTTAAG←5'): le endonuclesasi di restrizione, che hanno due subunità uguali, individuano la sequenza su uno dei due filamenti e procedono a tagliarlo.

Oltre agli enzimi di restrizione, un altro enzima fondamentale per il DNA ricombinante è la DNA ligasi, che catalizza la formazione di legami fosofidestere tra i nucleotidi esterni ai frammenti di restrizione “tagliati”. Il DNA risultante dall'inserimento così effettuato di un frammento di DNA estratto da un organismo (donatore) in un altro frammento (ospite) è detto DNA ricombinante; esistono due tipi di estremità per i frammenti di DNA, che devono combaciare tra i due DNA affinché funzioni la DNA ligasi:

• sticky (coesive): il doppio filamento diventa singolo per un tratto d'estremità; per legare, due estremità sticky devono avere basi che combaciano
• blunt (non coesive): le basi all'estremità sono tutte appaiate, e possono formare legami fosfodiesterici con altre estremità blunt

L'elettroforesi è un processo con cui si discriminano i frammenti di DNA di diversa lunghezza, disponendoli su una matrice gelatinosa e sottoponendoli a una differenza di potenziale elettrico (che determina un campo elettrico grossomodo uniforme). Poiché il DNA ha carica globalmente negativa per via dei gruppi fosfato, il DNA migra verso il polo positivo del generatore di tensione con una velocità che diminuisce con l'aumento del peso molecolare (e dunque della lunghezza in bp). Il gel è immerso in una soluzione salina, che bilancia il pH¹⁾ e conduce elettricità.

Il gel più frequentemente utilizzato è l'agarosio, polisaccaride estratto dalle alghe marine. Esso presenta maglie relativamente ampie, e consente di discriminare frammenti con differenze di lunghezza di 10-100 bp. Un'alternativa comune è il poliacrilammide, dall'elevata densità di maglie, che permette di distinguere frammenti con delta di 1 bp.

Il DNA viene disposto in pozzetti in prossimità del polo negativo, e in uno dei pozzetti viene introdotta una miscela detta «marcatore di peso molecolare», che crea delle “tacche” costituite da frammenti di nota lunghezza, fornendo una scala per leggere le lunghezze dei frammenti analizzati.

Per vedere il DNA, esso viene marcato mediante specifiche sonde nucleotidiche: sequenze oligonucleotidiche corrispondenti ai tratti da evidenziare, trattate con isotopi radioattivi degli elementi che le costituiscono, o con un colorante fluorescente.

L'uso di sonde consente di scoprire se i batteri hanno effettivamente inglobato il DNA ricombinante. Posti i batteri su una piastra di coltura che consente di districare le colonie, viene applicato sulla piastra un filtro in nitrocellulosa, a cui alcuni batteri si attaccano. Il dischetto viene trattato per denaturare il DNA e viene ibridato con sonde radioattive complementari al DNA ricombinante da trovare. Viene infine posto su una lastra fotografica e si osservano le macchie sul supporto fotografico, che si sanno corrispondere alle colonie di batteri che presentano il DNA ricombinante.

Il Southern blot permette di diagnosticare malattie genetiche, amplificando il segnale di sequenze brevissime di DNA, difficilmente evidenziabili con la sola elettroforesi e con i coloranti fluorescenti.

Un esempio di malattia diagnosticabile con questo metodo è l'anemia falciforme; essa causa la scomparsa di un sito di restrizione per l'enzima MstII; tagliando il DNA con l'enzima, si ha una differenza di lunghezza di 200 bp in eccesso rispetto alla forma normale del gene. Dopo la restrizione, i frammenti sono sottoposti a elettroforesi su gel e vengono trasferiti su nitrocellulosa; vengono denaturati e ibridati con una sonda che lega entrambi i frammenti antiparalleli; infine viene usata una lastra fotografica che viene impressionata dalle sonde radioattive, e si può misurare in bp la presenza delle bande risultanti, per determinare la presenza o meno del gene malato/sano, o di entrambe le forme (eterozigote).

La polymerase-chain reaction (reazione a catena della polimerasi), comunemente detta PCR, permette di moltiplicare una sequenza di DNA migliaia di volte in pochi minuti. Essa automatizza la duplicazione del DNA, usando DNA polimerasi batteriche termostabili (in particolare la Taq polimerasi), ossia che rimangono stabili ad alte temperature. Oggi per effettuarla si usano termociclatori: questi apparati sottopongono a cicli termici il DNA da replicare.

Ogni ciclo di PCR consiste in tre fasi:

1. denaturazione → avendo un frammento di DNA, è necessario linearizzarlo (separando i due filamenti polinucleotidici): artificialmente, al posto dell'azione dell'elicasi il campione viene riscaldato oltre 92 °C per pochi secondi. Ciò permette di denaturare il DNA, rompendo i legami H e separando i due filamenti polinucleotidici. I legami fosfodiesterici (covalenti) restano intatti.
2. ibridazione (annealing) → la temperatura viene abbassata sotto i 40-60 °C (viene scelta la temperatura ideale in base al segmento da replicare): i *primer* si appaiano al DNA a singolo filamento
3. allungamento → nella miscela di reazione, oltre ad avere il DNA da duplicare e i nucleotidi da unire, viene introdotta la DNA polimerasi e la miscela di reazione è posta in un pH idoneo alla reazione (soluzione salina), sono introdotti i primer complementari al segmento da duplicare, e in seguito all'annealing, agisce una particolare tipologia di DNA polimerasi: la Taq polimerasi (proviene da un batterio che vive nelle bocche dei vulcani subacquei). La temperatura viene alzata nuovamente per ridurre il tasso di formazione degli artefatti di replicazione, raggiungendo 72 °C. A partire dai primer che ormai sono legati al filamento stampo, inizia la sintesi.

I primer potrebbero agganciarsi anche se non vi è una perfetta complementarietà, quindi la temperatura deve essere elevata, difficoltando la formazione dei legami H e costringendo pertanto i due tratti (DNA ed RNA del primer) ad avere un gran numero di legami validi.